人外周血TH1/TH2/TH17染色

注意：采集外周血的抗凝管必須是肝素抗凝管，刺激劑盡量選用凍干粉自己配置；cocktail刺激劑是液體形式，PMA會因保存不當導致活性降低，影響刺激效果，而凍干粉形式的PMA較穩定，可以保證刺激效果。

人外周血TH1/TH2/TH17染色/流式檢測方法

細胞刺激步驟：（刺激體系1ml）

取人外周血（肝素抗凝）200 ml加入24孔板內，加入800 ml的*培養基，再加入1ml PMA(25ug/ml)、1μl Ionomycin（1mg/ml），輕輕吹打混勻細胞。放入 CO2培養箱培養刺激0.5小時后，每孔再加入2μl Brefeldin A（5mg/ml），輕輕吹打混勻細胞，放入CO2培養箱培養刺激3.5小時。

流式檢測步驟：

1、收集細胞于流式管內，500 g/8min離心，槍頭吸去上清，彈散管底沉淀，加入相應的表面染色抗體（CD3\CD8），彈散混勻。室溫避光孵育15分鐘后，500 g/8min離心，槍頭吸去上清；

2、彈散管底沉淀，加入1ml的固定/破膜工作液，（1ml Fixation/Permeabilization Concentrate加入3ml Fixation/Permeabilization  Diluent稀釋），旋渦混勻,現配現用；

3、室溫避光孵育30分鐘， 600 g/10min離心，在吸水紙上倒扣流式管棄去上清（此時細胞已在管底形成很牢固的沉淀，不容易丟 失），彈散管底沉淀；

4、加入1ml Permeabilization Buffer(此為10X，須與蒸餾水1：10稀釋成工作液)工作液離心洗滌細胞，破膜15分鐘（室溫避光）， 600 g/10min，在吸水紙上倒扣流式管棄去上清，彈散管底沉淀；

5、加入100μl Permeabilization Buffer（1x），同時加入相應的細胞因子染色抗體，室溫避光孵育15分鐘；

6、加1ml Permeabilization Buffer（1x），600 g/ 8min；在吸水紙上倒扣流式管棄去上清；彈散管底沉淀；

7、加入適量體積（建議300~500 ml）的PBS重懸細胞，并上機檢測并分析。

注意：1、根據實驗需求選擇相應的抗體，并做單染管用于調節補償（具體如何設置單染管，可參照Biogems流式手冊補償章節介紹）。

     2、盡量做同型對照，因細胞因子表達量不高（尤其是IL-4表達量非常低），細胞因子抗體對應的同型對照一般都要做。

     3、PMA刺激會導致人T細胞表面CD4表達的下調，PMA與Lonomycin聯合刺激下調非常明顯，4h刺激后會下調50%以上，6h刺激幾乎檢測不到CD4，因此我們的界定CD4+T細胞是通過染CD3和CD8，來圈CD3+CD8-的細胞。

     4、PMA對小鼠T細胞CD4表達影響很小，因此可以直接染CD4來圈門。

     5、因破膜劑對細胞損傷較大，建議離心后形成的細胞沉淀先彈散形成細胞懸液，在加入破膜劑，這樣會減少對細胞的損傷（形成的細胞碎片較少）。

人外周血TH1/TH17染色結果

注意：細胞破膜后對形態影響較小，因此可以直接圈淋巴門分析，在通過圈CD3+CD8-的細胞（此處未列出圖）來分析CD4+的細胞表達細胞因子的量。因此此圖橫坐標就直接標的CD4。

人TH1/TH2/TH17染色所需抗體及輔助試劑

方案提供：Biogems*。Biogems是PeproTech的流式抗體品牌，優勢是基于優異品質的較低價位，現正進行一系列*活動。

TH1/TH2/TH17流式抗體檢測配色方案產品由重慶市華雅干細胞技術有限公司授權代理，：

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